PAN Olsztyn

1. Metody in vivo:
   
   • metody biotechniki rozrodu świń i krów: synchronizacja rui, superowulacja, inseminacja;
   • ultrasonograficzna (USG) diagnostyka narządów rodnych świni, krowy i klaczy;
   • laparotomia świń i krów: kaniulacja naczyń krwionośnych układu rodnego; mikrodializa ciałek żółtych i innych struktur narządu rodnego;
   • przyżyciowe pozyskiwania jajników i ciałek żółtych krów (poprzez laparotomię lub kolpotomię);
   • biopsje błony śluzowej macicy krowy;

2. Metody in vitro:

   Izolacja enzymatyczna i hodowle komórkowe:
   
   • komórki nabłonka i tkanki łącznej błony śluzowej macicy świni, krowy, klaczy i kotki,
   • komórki steroidogenne ciałka żółtego krowy, klaczy i kotki,
   • komórki warstwy ziarnistej pęcherzyka jajnikowego krowy,
   • komórki śródbłonka naczyń  krwionośnych ciałka żółtego i błony śluzowej macicy krowy, klaczy i kotki,
   • komórki nabłonkowe zatoki mlekonośnej wymienia krowy.

   Inkubacje tkankowe:

   • skrawki błony śluzowej macicy świni, krowy, klaczy i kotki,
   • skrawki ciałka żółtego świni, krowy i klaczy,
   • skrawki zatoki mlekonośnej wymienia krowy.
3. Metody analityczne

   3.1  Metody biologii molekularnej:
   

   • ekspresja czynników pro- i antyapaptotycznych ( TNFα, IFNγ, IL-1α, Il-6, FasL, BCL2, BAX, Caspase3, Caspase8) i ich receptorów,
   • ekspresja enzymów szlaku steroidogenezy (3β-HSD, StAR, CYTp450),
   • ekspresja enzymów szlaku metabolizmu kwasu arachidonowego:
     
     • szlak powstawania leukotrienów (5-LOX) i ich receptorów
     • szlak powstawania prostaglandyn (PTGS-2, PGES, PGFS, 9KPGR, AKR1B5)
   • ekspresja enzymów związanych z syntezą kwasu lizofosfatydowego (PLD i PLA2) i jego receptorów (LPA1, LPA2, LPA3, LPA4),
   • ekspresja oksytocyny i  jej receptora,
   • ekspresja czynnika wzrostu nerwów i jego receptorów (TrkA, p75) na poziomie mRNA metodą RT Real Time PCR i semiquantitative RT PCR oraz białka metodą Western-blot,

   3.2  Immunoizotopowe oznaczanie (RIA) stężeń:
   

   • hormonów białkowych (LH, PRL) i receptorów  LH/hCG z użyciem preparatów znakowanych jodem (J-125),
   • hormonów steroidowych (P4, A4, T, E1, E2, kortyzol), prostaglandyn oraz metabolitu PGF2α – PGFM z użyciem hormonów znakowanych trytem (H3) oraz wykonywanie jodowań hormonów białkowych (LH, PRL) i cytokin (IL-1β, IL-6, TNF-α),

   3.3  Immunoenzymatyczne oznaczanie stężeń (ELISA):
   

   • hormonów białkowych (LH),
   • hormonów steroidowych (P4, T4, E2, kortyzol),
   • prostaglandyn (PGE2, PGF2α) oraz metabolitu PGF2α – PGFM,
   • oksytocyny i endoteliny przy zastosowaniu hormonów znakowanych peroksydazą chrzanową (HRP) lub biotyną.,

   3.4  Immunocytochemiczna lokalizacja:
   

   • enzymów szlaku przemian kwasu arachidonowego w jajniku, macicy oraz komórkach nabłonkowych zatok mlekonośnych (PTGS-2, PGES, PGFS, AKR1B5, 5-LO),
   • cytokin w jajniku i macicy (TNF-α, IL-1α, IL-1β i innych),
   • enzymów szlaku przemian cholesterolu w jajniku (P450scc, 3β-HSD, aromatazy) oraz komórkach nabłonkowych zatok mlekonośnych (11β-HSD, 3β-HSD),
   • receptorów (TNFR I, TNFR II, IL-1αR, IL-1 βR, LTRI, LTRII, GC-R, LPAR-1, LPAR-2, LPAR-3, LPAR-4, LPAR4, OTR, TrkA, p75),
   • neuroprzekaźników i ich markerów (NPY, VIP, SOM, SP, GAL, CGRP, PACAP, DβH, VACHT, nNOS),

   3.5  Analiza parametrów krytycznych i gazometrii krwi:
   

   Analiza parametrów gazometrii, elektrolitów i oksymetrii przy zastosowaniu analizatora parametrów krytycznych RAPIDpoint 405 (SIMENS).

   3.6  Morfometryczna analiza krwi:
   

   Podstawowe i rozszerzone badania morfologiczne krwi bydła, kozy, owcy, konia, świni, kota, psa, królika, świnki morskiej, szczura oraz myszy, przy zastosowaniu analizatora hematologicznego ADVIA 2120i (SIMENS).

   3.7  Immunochemiczna–chemiluminescencyjna analiza krwi:
   

   Oznaczanie hormonów steroidowych (P4, T, E2, kortyzol) oraz markerów stanu zapalnego (Il-1β, TNF-α, IL-10, LBP), przy zastosowaniu analizatora immunochemicznego IMMULITE®1000 (SIMENS).

ZAKŁAD MECHANIZMÓW DZIAŁANIA HORMONÓW

1. Przygotowanie materiału do badań:
   
   • Izolacja komórek: ciałka żółtego, myometrium, endometrium, nabłonka jajowodu,
   • Hodowle komórek i skrawków: inkubator (BB 6060, Heraeus, Niemcy);
2. Metody analityczne i pomiarowe:

• Ocena przeżywalności komórek (test cytotoksyczności): czytnik ELISA (Multiscan EX, Labsystems, Finlandia)

• Enzymoimmunologiczne oznaczanie hormonów steroidowych, białkowych i prostaglandyn (czytnik ELISA, Multiscan EX,Labsystems)

• Klasyczna technika PCR i jej modyfikacje: RT-PCR, nested-PCR, touchdown PCR (system dokumentacji żeli MiniBIS Pro)

• Pomiar zmian ekspresji genów metodą RT PCR i Real-time PCR:

• izolacja RNA, (spektrofotometr BioPhotometr, Eppendorf, oraz spektrofotometr Nonodrop)

  • odwrotna transkrypcja, PCR (termocykler MJ Mini BioRad)
  • system detekcji dla Real-time PCR (APB Prism 7300 Applied Biosystems, USA)
  • system do analizy obrazu MiniBIS Pro (DNR Bio Imaging System, Israel)

• 5’ i 3’ RACE PCR - szybka amplifikacja końców cDNA

• Pomiar ilości białka metodą Western Blot: Mini PROTEAN 3 System (system dokumentacji żeli MiniBIS Pro).

• Pomiar mobilizacji wewnątrzkomórkowych jonów Ca2+ z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Fura 2 (mikroskop Nikon Eclipse TS 100 z oprogramowaniem do analizy NIS-Elements Basic Research),

• Immunohistochemia (kriostat, analiza obrazu – mikroskop Imager Z1-Zeiss z oprogramowaniem Axio Vision 4.8).

• Pomiar aktywności motorycznej (kurczliwości) skrawków myometrium i jajowodu: tensometr (Hugo Sachs Elektronik, Niemcy – urządzenie na stanie ZLRF)

• Oznaczanie katecholamin metodą HPLC z detekcją elektrochemiczną (Hewlett-Packard, Series 1050)

ZAKŁAD LOKALNYCH REGULACJI FIZJOLOGICZNYCH

1. Wyznaczenie pI oraz masy cząsteczkowej analizowanych białek nasienia kręgowców. Mapowanie białek (protein mapping) plazmy nasienia ryb i ptaków. Analiza profili białkowych.

2. Izolacja białek i peptydów nasienia kręgowców, określenie podstawowych właściwości fizykochemicznych białek.

3. Izolacja białek i peptydów, rozdział peptydów powstałych w wyniku trawienia białek, przygotowanie preparatów do sekwencjonowania i spektroskopii mas.

4. Pomiar koncentracji plemników, oznaczenie podstawowych biochemicznych wyznaczników jakości nasienia, pomiar aktywności antyoksydacyjnej nasienia, analizy kinetyczne (określenie stężenia enzymów i inhibitorów, wyznaczenie stałych asocjacji dla oddziaływania inhibitor – proteinaza, wyznaczenie widm białek w zakresie UV i światła widzialnego.

5. Elektroelucja białek z żelu.

6. Pomiar koncentracji i przeżywalności plemników.

7. Ocena stanu genomu plemników.

8. Wizualizacja profili białkowych plazmy nasienia.

9. Transfer białek na membranę, analiza Western blot

10. Pomiar ciśnienia osmotycznego plazmy nasienia

11. Obserwacja i analiza fluorescencyjna komórek somatycznych i gamet

12. Rozdziały białek i kwasów rybonukleinowych na żelach poliakrylamidowych i agarozowych.

13. Transfer białek na membranę, analiza Western Blot

LABORATORIUM BIOLOGII MOLEKULARNEJ

1. Immunoenzymatyczne (ELISA) i immunoizotopowe (RIA) oznaczanie stężeń hormonów:
   

   • hormonów białkowych (LH, PRL) i receptorów LH/hCG z użyciem preparatów znakowanych jodem (J-125)
   • wykonywanie jodowań hormonów białkowych (LH, PRL) i cytokin (IL-1β, IL-6, TNF-α),
   • hormonów steroidowych (P4, A4, T, E1, E2, kortyzol),
   • prostaglandyn (PGE2, PGF2α) oraz metabolitu PGF2α – PGFM
   • oksytocyny i endoteliny przy zastosowaniu hormonów znakowanych peroksydazą chrzanową (HRP) lub biotyną.

2. Analiza parametrów krytycznych i gazometrii krwi:
   Analiza parametrów gazometrii, elektrolitów i oksymetrii przy zastosowaniu analizatora parametrów krytycznych RAPIDpoint 405 (SIEMENS):

   • gazometria: pH, pCO2, pO2,
   • elektrolity: NA+, K+, Ca++, Cl-,
   • glukoza, HCT,
   • oksymetria: sO2, FO2Hb, FCOHb, FHHb, FMetHb, THb,
   wraz z wieloma wyliczanymi parametrami pochodnymi.
3. Morfometryczna analiza krwi:
   

   • dwutorowy pomiar leukocytów w dwóch niezależnych kanałach
   • podstawowe i rozszerzone badania morfologiczne krwi bydła, kozy, owcy, konia, świni, kota, psa, królika, świnki morskiej, szczura oraz myszy, przy zastosowaniu analizatora hematologicznego ADVIA 2120i (SIEMENS).

   Wymagana objętość próbki krwi do badań wynosi 157 µl.

4. Immunochemiczno–chemiluminescencyjna analiza krwi przy zastosowaniu analizatora immunochemicznego IMMULITE®1000 (SIEMENS):

   • analiza stężeń hormonów nadnerczy/przysadki, płciowych (np. P4, T, E2, kortyzol),
   • analizy z zakresu fizjologii tarczycy,
   • analizy stężeń czynników wzrostu,
   • analiza markerów stanu zapalnego (IL-1β, TNF-α, IL-10, LBP),
   • analiza wskaźników alergii, anemii, cukrzycy,
   • analiza markerów kardiologicznych, chorób zakaźnych, nowotworowych,
   • stężeń leków
   Materiałem do analiz jest surowica, osocze, medium hodowlane.

5. Analiza specyficznych immunoglobulin E przy zastosowaniu aparatu ImmunoCAP 100:

   • Phadiatop - test przesiewowy różnicujący pacjentów atopowych od nieatopowych,
   • całkowita IgE,
   • całkowita IgE (niski poziom) - dla małych dzieci,
   • specyficzne IgE  - ponad 500 alergenów pojedynczych oraz 70 mieszanek,
   • białko eozynofilowe ECP - monitorowanie leczenia astmy,
   • tryptaza - monitorowanie stanu anafilaksji,
   • gliadyny IgA i IgG – nietolerancja pokarmowa u dzieci,
   • specyficzne IgA w odniesieniu do poszczególnych frakcji mleka,
   • specyficzne IgG oraz IgG4,
   • przeciwciała przeciwtarczycowe: anty-TPO, anty-TG,
   • ponad 22 parametry z zakresu chorób autoimmunologicznych w klasie IgG, IgA,
   W celu wykonania analizy niezbędne jest 40 µl surowicy pacjenta.

6. Jakościowe oznaczania in vitro ludzkich przeciwciał klasy IgG oraz IgE z zastosowaniem aparatu Euroimmun:

   • Metoda immunoblottingu do oceny swoistych przeciwciał klasy IgE skierowanych przeciwko alergenom w surowicy pacjenta,
   • Dostępne panele zawierające kombinacje alergenów po 20 różnych na jednym pasku testowym (wziewny, pediatryczny wziewny, pokarmowy, atopowy), dwa dla jadów owadów, oraz „Profil pediatryczny” zawierający 27 najpopularniejszych alergenów m.in.: spośród alergenów pokarmowych białko i żółtko jaja, białka mleka, mąka pszenna, ryż, soja, owoce i warzywa, a spośród wziewnych: pyłki traw i drzew, alergeny roztoczy i sierści zwierząt.
   Do wykonania analizy niezbędne jest 100 µl surowicy pacjenta.

7. Wykrywanie białek czynnościowych (cytokiny, białka efektorowe, receptory, markery powierzchniowe lub przeciwciała) wydzielanych przez pojedyncze komórki przy zastosowaniu zestawu ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay).